Estandarización de PCR con primers para la región ITS en ADN vegetal
Standardization of PCR with primers for the ITS region in plant DNA
Andrade Hugo
Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Esta dirección de correo electrónico está protegida contra spambots. Necesita activar JavaScript para visualizarla.
Lapo Jessica
Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Esta dirección de correo electrónico está protegida contra spambots. Necesita activar JavaScript para visualizarla.
Reyna Armando
Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Esta dirección de correo electrónico está protegida contra spambots. Necesita activar JavaScript para visualizarla.
Baer Natasha
Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Esta dirección de correo electrónico está protegida contra spambots. Necesita activar JavaScript para visualizarla.
Resumen
La región espaciadora interna transcrita de ADN ribosomal (IST), es ampliamente utilizado en análisis de taxonomía y filogenia molecular, principalmente en hongos y plantas. Existen distintas combinaciones de primers que han sido diseñados para dichos análisis en hongos como ITS1 y ITS4 pero que pueden ser utilizados en ciertas especies vegetales, considerando simbiosis existentes con hongos en los ecosistemas naturales. En el presente estudio, se estandarizó una PCR con el objetivo de validar los primers ITS1 e ITS4 en distintas especies vegetales para su posterior análisis mediante RFLPs o secuenciación con fines de filogenia molecular de ADN genómico de Rubus ulmifolius, Solanum lycopersicum, Eugenia stipitata, Zea mays y Raphanus sativus; la estandarización de la PCR con lo primers ITS1-f e ITS4-r se realizo mediante un gradiente de temperatura de annealing desde 52°C a 60.1°C, utilizando concentraciones de buffer[1X], MgCl2 [2 mM], primers [0.4 μM], dNTPs [200 μM] y Taq polimerasa [0.5 U/ μL]. Se pudo determinar que la mejor temperatura de anneanling fue de 58.6°C con lo que se obtuvo una banda clara y uniforme de aproximadamente 600pb para las muestras de Eugenia stipitata y Raphanus sativus. Los resultados se contrastaron a través de una simulación en Primer Blast de la plataforma NCBI, con el fin de identificar las secuencias que posiblemente se lograron amplificar. Estos resultados iniciales serán complementados con la aplicación de otras técnicas moleculares para los estudios de filogenia vegetal.
Palabras Clave: PCR, ADN vegetal, Técnicas moleculares, ITS
Summary
The internal transcribed spacer region of ribosomal DNA (ITS) is widely used in taxonomy and molecular phylogeny analysis, mainly in fungi and plants. There are different combinations of primers that have been designed for such analyzes in fungi such as ITS1 and ITS4 but that can be used in certain plant species, considering existing symbiosis with fungi in natural ecosystems. In the present study, a PCR was standardized in order to validate the ITS1 and ITS4 primers in different plant species for later analysis by RFLPs or sequencing with purposes of molecular phylogeny of genomic DNA of Rubus glaucus, Solanum lycopersicum, Eugenia stipitata, Zea mays and Raphanus sativus; PCR standardization with the ITS1-f and ITS4-r primers was performed using an annealing temperature gradient from 52 ° C to 60.1 ° C, using buffer concentrations [1X], MgCl2 [2 mM], primers [0.40 μM], dNTPs [200 μM] and Taq polymerase [0.5 U/ μL]. It was determined that the best annealing temperature was 58.6 °C, which resulted in a clear and uniform band of approximately 600 bp for the simples of Eugenia stipitata and Raphanus sativus . The results were contrasted through a simulation in Primer Blast of the NCBI platform, in order to identify the sequences that could possibly be amplified. These initial results will be complemented by the application of other molecular techniques for studies of plant phylogeny.
Key words: PCR, Plant DNA, molecular techniques, ITS
